簡(jiǎn)要描述:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出,由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),目前已得到廣泛應(yīng)用。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR:在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,Z后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
定量(Absolute Quantification,AQ)
分析用于確定未知樣本中某個(gè)核酸序列的量值,即通常所說(shuō)的拷貝數(shù),應(yīng)用與病原體檢測(cè),轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè),及基因表達(dá)研究。
SYBR Green特性:
(1)只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。
(2)變性時(shí),DNA雙鏈分開(kāi),無(wú)熒光。
(3)在延伸結(jié)束階段采集熒光信號(hào)。
(4)SYBR Green也能和非特異性的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光,所以必須在反應(yīng)結(jié)束時(shí)做熔解曲線分析。
TaqMan探針的特性:
(1)5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R),如FAM、VIC等
(2)3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q)
(3)探針完整,R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ,無(wú)熒光, R與Q分開(kāi),發(fā)熒光(4)Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性,可水解探針。
定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品:
(1)含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒
(2)含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的cDNA
(3)PCR的產(chǎn)物,可分別做系列稀釋。
服務(wù)流程:
步驟 | 客 戶 提 供 | 服 務(wù) 內(nèi) 容 | 基 屹 提 供 |
1 | 新鮮的且盡量多的材料;已知的全長(zhǎng)基因序列;盡可能詳細(xì)的背景資料:DNA/ RNA來(lái)源、豐度等。 | DNA/RNA提取,根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針。 |
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2 | 純化好的DNA/RNA(大于5 ug/樣品);已知的全長(zhǎng)基因序列;盡可能詳細(xì)的背景資料:DNA/ RNA來(lái)源、豐度等。 | 根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針。 |
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3 |
| 以DNA為模板,對(duì)目的基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)分析 | 提供完整的定量分析結(jié)果、實(shí)驗(yàn)熒光定量擴(kuò)增曲線及詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟。 |
注意:客戶可根據(jù)所能提供的起始材料不同,選擇從步驟1或2啟動(dòng)項(xiàng)目。